Иммунопероксидазный анализ или иммунофлюоресценция: какой метод более достоверен для интерпретации почечной биопсии?

На протяжении развития иммуногистохимических методов важным фактором оставалось стремление увеличить чувствительность антител к низким концентрациям антигенов. Это позволило объединить морфологический анализ тканей с результатами молекулярно-биологических тестов. В отличие от жидкостных иммунологических методов, которые выявляют белки, присутствующие в ткани в высоких концентрациях, сохранность антигена на фиксированных тканях варьируема и непредсказуема. Изготовление срезов из тканей, зафиксированных формалином и залитых в парафин, обеспечивает наилучшую морфологическую сохранность, но зачастую становится препятствием для исследований, где требуется взаимодействие с «активными» антигенами.

• Иммунопероксидазный метод основан на окислении донора электронов комплексом ферментной метки (пероксидаза) с субстратом (антиген). Некоторые доноры электронов при окислении окрашиваются и поэтому называются хромогенами. На этом эффекте основана окраска клеточных маркеров, определяющих специфический фенотип.
• При иммунофлюоресцентном методе антитела химически конъюгируют с флюоресцентными красителями. Меченые антитела связываются с интересующим антигеном, что позволяет обнаружить его с помощью флюоресценции.

203696-image-1.png

В каждом случае отмечается сходство паттернов иммуногистохимических реакций при применении ИПМ и ИФМ. В контексте болезни минимальных изменений ИПМ позволяет определять слабые мезангиальные отложения IgM, которые не обнаруживаются методом ИФМ. Благодаря ИПМ можно наблюдать структуру ткани и выявлять закономерные связи между такой структурой и иммуногистохимической реакцией, тогда как визуализационная возможность ИФМ не столь очевидная для изучения гистоархитектоники ткани¹.

Более пятидесяти лет ИФМ остается наиболее распространенным методом для обнаружения и визуализации различных молекул в биологических образцах, а также считается «золотым стандартом» при исследовании биоптатов почки. ИФМ представляет собой метод визуализации антигенов с использованием антител, меченных флюорохромом. Это распространенная лабораторная методика, применяемая в различных областях медицины. Данное решение, основанное на исследованиях Кунса и Каплана, широко используется как в научных работах, так и в клинической практике. Области его применения включают оценку параметров клеток в суспензии, культуры клеток, тканей, сфер и микроматриц для обнаружения специфических белков. ИФМ может проводиться как на свежих, так и на фиксированных образцах.

При проведении ИФМ антитела химически связываются с флюоресцентными красителями, такими как флуоресцеин изотиоцианат (FITC) или тетраметил-родамин изотиоцианат (TRITC). Существуют два способа проведения ИФМ: прямой и непрямой. В первом случае само антитело против интересующего белка химически маркируется флюоресцентным красителем. При непрямой ИФМ первичное антитело не маркируется, а метку несет вторичное антииммуноглобулиновое антитело, направленное против определенной части молекулы первичного антитела^{2, 3}.

203696-image-2.png

В 1968 году была предложена пероксидазная методика ИГХ, которая не только стала первым способом окраски антителами парафиновых срезов, но и помогла преодолеть некоторые ограничения ранее применявшихся флюоресцентных исследований. С самого начала существовало беспокойство относительно недостаточной воспроизводимости результатов ИПМ в отношении фиксированных формалином и залитых в парафин препаратов, а также воспроизводимости результатов как в пределах одной лаборатории в разные дни, так и в иных лабораториях. По мере развития техник ИПМ их область применения в диагностических и исследовательских целях расширяется. Многочисленные способы амплификации значительно улучшили метод, позволив обнаружить множество антигенов, выявление которых при фиксации или заливке в парафин ранее считалось невозможным. С развитием технологий появляются новые панели маркеров, обеспечивающие более глубокое понимание этиологии и патогенеза заболеваний⁴.

Различные варианты окрашивания при иммунопероксидазном методе²

203696-image-4.png

Современные методы ИФМ и ИПМ продолжают совершенствоваться, и каждый из них обладает своими достоинствами и недостатками, предоставляя исследователям и клиницистам обширный инструментарий, который значительно влияет на процесс иммунодиагностики¹.

ИПМ и ИФМ: основные преимущества и недостатки методов¹

203696-image-5.png

203696-image-6.png

В 2015 году были опубликованы результаты клинического исследования, проведенного профессором Мохаммадом Джафари и его коллегами. Авторы исследования пришли к выводу о том, что по сравнению с ИФМ ИПМ показывает уступающий диагностический уровень: чувствительность ниже на 11,45%, а специфичность меньше на 30,78%. Несмотря на то что ИПМ имеет более низкую общую прогностическую ценность, чем ИФМ, его воспроизводимость позволяет ему оставаться альтернативным или резервным способом исследования биопсийных материалов почек, особенно в случаях, когда проведение ИФМ не дает значимых результатов или недоступно⁵.

Образцы почечной биопсии, окрашенные IgG, IgM, C1q, IgA и C3c методами ИФМ и ИПМ¹

203696-image-7.png

Данные клинического исследования д.м.н. Йохана Молне и соавторов показали совпадение заключений для этих методов лишь в 71% случаев (282 из 398 наблюдений). Большинство расхождений (74 из 116) были положительными по ИПМ, с мезангиальными отложениями IgM и C1q, которые не были обнаружены методом ИФМ. Статистически значимых различий в результатах между ИФМ и ИПМ для IgG, IgA и C3c не было (P > 0,2), однако для маркеров IgM, C1q отмечалась значимая разница в их детекции (P < 0,001)¹.

По данным другого клинического исследования, описанного Свасти Шубхамом и соавторами, подтвердилось отсутствие различий в результатах между ИФА и ИПМ для IgA, IgM и IgG. При этом статистически значимые различия были обнаружены в результатах оценки белков комплемента, что несколько снижает ценность ИПМ в диагностике комплемент-опосредованных заболеваний⁶.

Метод ИФМ для изучения ткани почек остается «золотым стандартом» нефробиопсии, обеспечивающим самую высокую чувствительность среди тканевых исследований компонентов комплемента и иммуноглобулинов. Он обладает множеством преимуществ и подтвердил свою ценность в выявлении расположения известных антигенов в клетках или специфических последовательностей ДНК в хромосомах. Благодаря сочетанию высокой чувствительности и мощного разрешения при визуализации антигенов ИФМ остается одним из основных методов исследования на протяжении многих лет, что объясняет необходимость ее использования патологами. При этом продолжают развиваться новые методы с применением амплификации, тем самым предоставляя исследователям и клиницистам широкий арсенал инструментов для диагностики. Важно отметить, что при выборе способа проведения исследования важную роль играет опыт использования морфологом того или иного метода диагностики, что существенно влияет на точность постановки диагноза.

• ИГХ — иммуногистохимическое исследование;
• ИПМ — иммунопероксидазный метод;
• ИФМ — иммунофлюоресцентная микроскопия;
• СМ — световая микроскопия;
• IgA — иммуноглобулин A;
• IgM — иммуноглобулин М;
• FITC (fluorescein isothiocyanate) — флуоресцеин изотиоцианат;
• TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate) — тетраметил-родамин изотиоцианат;
• РАР (peroxidase, anti-peroxidase) — пероксидазно-антипероксидазный метод;
• LSAB (labeled streptavidin-biotin) — методика с меченным стрептавидин-биотином;
• ABC (avidin-biotin-peroxidase complex) — авидин-биотиновая непрямая методика;
• EnVision^TM — двухэтапный полимерный метод;
• ЭМ — электронная микроскопия.

1. Johan Mölne, Michael E. Breimer, Christian T. Svalander. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases, 2005; 45(4): 674–683.
2. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.: DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова. — М., 2011. — 224 с.
3. Zaqout S, Becker LL and Kaindl AM. Immunofluorescence Staining of Paraffin Sections Step by Step. Front. Neuroanat. 2020. 14:582218. doi:10.3389/fnana.2020.582218.
4. Nakene PK. Simultaneous localization of multiple tissue antigens using the peroxidase labeled antibody method: A study of pituitary glands of the rat. J Histochem Cytochem. 1968; 16: 557–560.
5. Jafari M, Monsef-Esfahani A, Solimani B. Diagnostic value of immunoperoxidase staining and immunofluorescence in the study of kidney biopsy specimens. Iran J Kidney Dis. 2015; 9(4): 286–90.
6. Shubham S, Bhardwaj M, Mahapatra HS. Comparative evaluation of immunoperoxidase versus immunofluorescent techniques in interpretation of kidney biopsies. Indian J Pathol Microbiol. 2016; 59(3): 305–9.